2. Homogenization

준비물: RIFA buffer, 쓰레기통, 1000㎕ 피펫, 팁, 원심분리기?, 아이스박스, 스터... 균일화용 튜브

 

 

1. -80도 냉동실에서 적출한 근육 샘플을 얼음 통(?)에 담아둔다.

 

 

2. homogenizer용 튜브를 샘플 수에 맞게 준비하고 라벨링한다.

(이 때, 1.5-e-tube도 샘플수에 맞게 준비하고 라벨링)

 

 

3. 종이컵 사이에 튜브를 끼우고 'TARE' 버튼을 누른 후 샘플을 옮겨 담는다.

 

4. 샘플 무게를 측정 후 샘플 무게에 맞게 RIFA buffer를 넣는다

* buffer volume = sample 무게 x 10

* Rat의 경우 근육 크기가 커 powder 작업 후(0.05g 정도 사용)

균질화 과정이 진행되어 14배 정도 사용

* mice는 근육 크기가 작아 바로 샘플을 사용하기 때문에

버퍼의 용량이 샘플 무게의 10배 정도 사용해도 괜찮다.

RIFA buffer
+ Add 700 ml of water then             1L            0.5L.
     50mM Tris HCl                         7.88g         3.94g(Tris 3.03 HCl 0.919)
     150mM NaCl                            8.77g         4.38g
     1mM EDTA                               0.3722g      0.186g
Adjust pH to 7.4
Then add:
     10% NP40                                 25ml
      0.5M NaF                                  2ml
     10mM Na pyrophosphate          4.48g
            0.25% Na Deoxycholate     2.5g
Na deozxycholate is light sensitive-once added protect from light  >> 은박처리
Bring up to 1L with water

 

 

 

5. 에탄올을 사용하여 유리 막대 소독

 

6. 유리막대 중앙에 맞게(고무패킹까지) 넣고 기계 작동

* 돌아가는 궤적 확인하기(최대한 안 큰게 좋음)

 

7. 샘플 얼음컵에 넣은 상태로 기계 사용하여 균질화(15분 정도)

 

8. 1.5-e-tube에 옮기기

 

 

9. 원심분리기 12,000~14,000RPM,4도, 30분(보통 14,000RPM)

 

10 .-80도 냉동 후(1시간 이상) 얼음 반 물 반 박스에

30~40분 해동 >  mix > -80도 냉동(1차)

 

11.해동(얼음 반 물 반) > mix (2차) 다시 -80도에 냉동

 

12.해동(동일) > mix (3차)  -80도 overnight

 

13.정량하기 전 BSA 1X와 같이 해동(only ice, 3시간)

 

* 샘플 냉동실에 넣고 사용기구 정리하기

* 세제 > 물 > Pure water > 제자리에 건조(따로 물기 안 닦음)